核酸适配体的未来何在？---微信群内初步探讨
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核酸适配体的未来何在？--微信群内初步探讨
题记：核酸适配体在国内受到越来越多人的关注，近些年发表的文章增速很快，已经超越美国。但是核酸适配体应用的发展也存在一些问题，如利用SELEX技术筛选核酸适配体时，目前的成功率依然较低，使可以应用到实际检测或者治疗中的核酸适配体少之又少。另一方面，作为药物时，核酸适配体的相对分子量较小，因此相较于抗体，其有较好的组织穿透性和较低的免疫原性，但未经修饰的核酸在机体内易被肾脏过滤和核酸酶降解，这也提高了核酸适配体应用的门槛。为提高核酸适配体筛选的效率和成功率，已发展出一些改进的SELEX技术，但相关研究较困难，进展缓慢，这也严重制约了下一步的应用。目前研究热点依然是核酸适配体的应用，但是适配体的修饰到应用目前还缺乏通用化的解决方案。鉴于核酸适配体的系列问题，在微信里展开了一场讨论，笔者进行了简单的总结，如下。
一、何时中国会出现第一个商品化的核酸适配体试剂盒，第一个核酸适配体药物呢？
什么类型的试剂盒呢？试剂盒分专业人士使用和生产一线，那些用于前处理或诊断的kit应较快，用作药物的话周期较长。
重点：诊断；治疗；器件。有老师给出观点，适配体可以替代抗体和非特异性染料，作为高特异性荧光分子探针，结合单粒子示踪技术，用于基础研究。
适配体传感器目前的研究很多，体外应用的稳定性比体内要高，难度小。目前知道罗氏的聚合酶热启动用了，效果很好！
二、虽然是个老问题，讨论了很多，但我觉得很有必要讨论一下经典selex技术有什么问题，进一步归纳总结一下，如何有效预防和控制。这应该是所有改进版筛选技术的基础。
观点1：筛选技术方面的瓶颈是通用型的高通量的表征技术。
观点2：我认为结构不稳定，重复性差是是致命的缺点。哪种重复性呢？筛选的重复性，还是特异性结合的重复性？结构的不稳定和我们在筛选过程中运用的条件，如温度？buffer？都有关系。筛选过程中随机性很明显，也是因为适配体的动态性，结构柔性所致。我们做了很多高通量测序，也还没有完全搞清楚。复杂程度超出想象。
非编码RNA的柔性，是其优势。它能在不同的条件下，发挥不同的作用。但对于适配体的柔性，就让我们这些研究者很头疼。那么选择适配体的时候是否可以进行刚性结构的筛选，虽然多样性减少，但是后期使用的重现性增大？
DNA的柔性比RNA低，但是单链DNA分子的结构也很复杂，有些文库设计，会有帮助，例如末端匹配的文库。结构决定功能，结构不稳定的话，很难去进行功能研究，然后又决定了筛选时的效率不会很高。其实蛋白的结构也是不稳定的，但活性位点的暴露程度对发挥作用也很重要。
三、希望知道SELEX成功关键的步骤，多次筛选的序列丢失怎样避免?
符合进化理论，丢失无法避免；序列丢失，根据我的筛选经验，一般一次筛选，最终有一半适配体会出现丢失。
丢失的另一个因素会不会是有序列污染，使得在序列池中占了绝对多数，这个也是有可能的，同时针对两种靶标同时进行筛选，是会出现交叉污染。我们高通量测序中，发现大量富集的序列，其实都没有亲和力，现在还没想明白，他们为什么没有被筛选淘汰掉？而且筛选失败的库去测序，也会发现序列富集。高通量测序具有偏好性，最近我们在研究
对筛选而言，文库事实上是否足够‘随机’也是关键，即文库可能先天存在某些偏性。库容量相比随机序列所有的可能性来说还是小的，所以每次库都会有比较大的差异吧。以前有人研究过库，各个碱基合成效率不一致, 这个合成库的随机性，记得好像有报道。我觉得很难说清楚。ATGC合成效率不一致，这是确定的，理论上来讲，找几个不同的公司去合成库，然后混到一起，可能会更好一些。
也许我们本不需要有多随机的文库，而是需要有偏性可大致预设的文库，于筛选而言更有效率。已经得到的适配体的立体结构有一定的特点，可以用来设计序列库，牺牲一些多样性是值得的。
四、能不能请计算的老师聊聊柔性的本质？在多大范围内的柔性尺度最关键？
结构不稳定性是在离子环境中，由于疏水作用力和氢键的作用，DNA/RNA分子的骨架会发生微调，与蛋白相互作用的氢键会出现较大差异，导致的分子柔性增大, 这一部分有文献报道。RNA/DNA适配体的三维模型构建中的分子动力学研究。同时，这种柔性是不是也是发挥功能的优势，例如诱导契合学说。还有，适配体应用重现问题，我现在更怀疑这种柔性分子不仅仅对缓冲液离子强度，温度什么的原因，甚至适配体相互之间也有影响，这个影响我更倾向于构象的变化，就是这种动态变化很难让他稳定。核酸序列浑身长满了钩子（各种功能基），自身卷曲，分子间结合，看哪种更稳定。
五、核酸适配体的前景如何
观点1：抗体具有垄断性，适体完全公开，得不偿失。从长远说，适配体可以通过专利机制来保护，关键是突出表现出有别于抗体的优势，检测产品重要的一个性质就是重复性，适配体检测重复性是不是可以与抗体相当？检测类产品准入门槛低点, 检测试剂盒审批也简单, 检测类产品有几点要关注的，相比抗体来说，适配体的亲和力如何？适配体检测的重复性如何？
观点2：简单来讲，前景包含三种：检测、治疗和基础研究，目前希望取代部分抗体作用，在诊断领域可以快速产业化有前景，可惜没有成功的先例。检测和临床医学都会有广泛应用, 用作样品前处理试剂盒也行。
观点3：接触过几个做适配体的行业内老师，普遍的观点是，适配体虽然看起来也有很多，但是亲和力还是跟抗体没办法比。大家都是做这个的，觉得怎么样？现在被筛选出来的适配体种类还是太少，好用的适配体就少之又少。
观点4：体外检测是一个方向, 临床医学的精度要求高，加上仪器设备，成本其实不低，看好在食品安全快检领域的前景，如果做应用的同行，估计大家现在都在做检测,医学检测门槛高，个人感觉适配体最先会在环境、食品检测取得突破。
观点5：成功率+性能+稳定性+生产成本，决定了前景。
观点6：理性设计，定向筛选，可能是个方向。
观点7：产业化做药和试剂盒我都不看好，唯一优势是做电化学元件，因为这个是抗体做不了的。首先国内业界不会主动创新，从CFDA到上市公司，不会投资做这种早期产品，国外大公司已经大部分放弃了核酸药物，主攻抗体药物, 如果要拿证，核酸适配体基本没有任何优势，做检测试剂盒没有前例，CFDA不批，即使批了，现有医院体系不兼容，如果没有巨头去推进，基本没有空间
观点8：将aptamer用于活体动态实时检测，也是一大方向。是抗体做不了的。
观点9：针对罗老师提出的前景的问题，我个人有如下感想：我是做检测的，当我设计出一个对某种靶标有特异性响应的检测体系，这个体系对很高浓度的非靶标不响应而对浓度很低的靶标响应时，我就觉得适配体真神奇，前景很广；然而将这个检测体系用于稍微复杂的实际样品检测时，该体系立马挂掉，这个时候便会觉得无比沮丧，直问适配体前景在哪？怎样才能实用？个人觉得aptamer在大分子药物检测方面具有前景。现在蛋白多肽药物很火热，缺乏专属性分离方法。
观点10：食品安全领域对诊断的灵敏度要求高，适配体能解决亲和力和信噪比问题吗？更别说稳定性问题了。很难实现针对复杂体系的应用，最好在筛选的时候，就用比较复杂的环境筛选。这个问题个人觉得是因为筛选是在缓冲液体系完成的，而不是在复杂体系，针对复杂的应用体系，类似Elisa的三明治法会不会有效，多个适配子共同产生信号才是真信号？但是如果使用比较复杂的环境，筛选成功率是否又会很低，筛出来的适配体是否在纯净体系里又会挂掉？感觉二级三级结构不稳定才是适配体不稳定的主要原因。可能需要在链上加互相疏远的基团使其不会折叠的时候随机的交联在一起造成亲和力下降甚至丢失。
观点11：对于一些小分子，制备抗体是很难的，但是适配体好像能够解决这个问题;
观点12：抗体药物实际上现在面临很大的问题，因为抗体比较大，会有免疫原性。这个是个比较头疼的问题。 所以现在才有纳米抗体和适配体的研究方向/据说有一半的抗体有问题, 根椐我们的教训，一半可能还不止。实际样品的检测，为了提高检测成功率，我的经验是要对待测样品加不少的前处理，有价值的靶标都被抗体占领了，现在的靶标有价值，有市场的少，例如临床常用的标志物即使筛了可能发不了论文，市场又抢不过抗体。比如乙肝表面抗原为什么没人去筛。说实话，大家心里都知道适体相对于抗体的优点，但是局限性还是很大。适配体要应用的话应该是需要先筛选出好的序列，个人觉得，用于检测的适配体不需要特别高的亲和力，如果一个适配体kd值在uM级，通过各种检测技术可以实现nM的灵敏度
有老师推荐一篇论文，适配体在应用领域的尝试，这篇文章的思路就很不错。One-step tumor detection from dynamicmorphology tracking on aptamer grafted surface
六、想请教各位将适配体修饰到纳米颗粒上有哪些成熟方法？除末端巯基化处理之外。
群里刘珏文老师 2012年 JACS文章 ，我至少看了20遍。适配体修饰到纳米颗粒上，刘珏文老师大牛。作者回答：我们这个低pH方法对A和C比较多的序列比较好。Liu Juewen JACS那篇修饰过程非常快，也有一些人重现有困难。对裸金颗粒要求比较高，mirkin比较经典72小时的效果好。
别的小伙伴回复：我重现的很好，速度很快。我现在也是参考刘老师那篇ph3的文章在做，重现性很好，节省了很多时间。刘老师那是ph3方法，如果纳米粒或纳米粒者其他功能性基团不能在酸性条件下，就不能用这个方法。
娄老师团队这篇文章的修饰方法，也很有借鉴意义。Rapid, Surfactant-Free, andQuantitative Functionalization of Gold Nanoparticles with Thiolated DNAunder Physiological pH and Its Application in Molecular Beacon-BasedBiosensor
金颗粒还有SPR本身都是通用性比较高的方法，但是很多待分析物不适合。有些目标是直接会吸附金颗粒表面，甚至破坏金颗粒的稳定性。有些金颗粒的实验，用ATP的aptamer，腺苷可以做但是ATP却不能
如果对二级结构的稳定性要求比较高，可以试试娄新徽老师报道的聚乙二醇spacer的核酸在纳米金上组装的方法，我们发现只要加六个乙二醇单元就可以加速核酸在纳米金上的上载了。生工可以合成，具体可以看论文。
其他：
候选适配体库用高通量测序分析比较好，但测序后数据量很大，如何进行分析才能找到亲和力最高的适配体呢？
有谁了解湖南大学王柯敏教授课题组的工作？在大会上他show出他们的NFSC重大项目的研究成果，我印象非常深的是他们已经有了可以预报SELEX筛选结果的理论模型，可以防止漏报，提供新序列等等。王柯敏组:想要建立模型的基础是要有大量测序与验证的结果，并且结合比较稳定才可以建立后期的模型进行研究。本身识别稳定，这样建立模型预测出来的aptamer的验证成功率才会好！
加拿大的Neoventure有黄曲霉素检测试剂盒；另外有个SOMAscan assay，提供各种蛋白质检测，其试剂盒的核心成分就是适配子，目前的人源蛋白靶标，他们做了2000个左右。
小结：总体来说，核酸适配体在早期检测、成本及灵敏度等方面有优异表现。希望待相关技术成熟后，好用的适配体越来越多，可以跟抗体相结合，共同承担起当前诊断领域中的检测体系。在疾病治疗方面，核酸适配体距临床应用尚有一段距离，不过基础研究已证明核酸适配体有这样的价值和潜力。相信随着SELEX技术、核酸适配体改造修饰方法等的进一步发展，未来核酸适配体极有可能像抗体一样在各领域中发挥重要作用。
因学识有限，对各位老师在群里给出的解答 理解的难免不够充分，恳请各位读者批评指正！欢迎大家留言指出！
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昂普拓迈(Aptamy)致力于推动核酸适配体产业的发展，提供筛选周边产品，筛选服务，筛选培训。已经为来自全国的多个高校科研团队提供数百个科研产品及解决方案。
