#文献分享# 分子界的杀手媒婆——Aptamer介导的蛋白降解

今天给大家分享一篇发表在ACS Chemical Biology上的文章“Aptamer and N‑Degron Ensemble (AptaGron) as a Target Protein Degradation Strategy”，该研究建立了适配体与N-degron组合系统（AptaGron），成功降解 Tau、nucleolin和eIF4E这三种缺乏小分子配体的目标蛋白，有力彰显 AptaGron作为靶向蛋白降解稳健平台的潜力，为攻克蛋白降解难题提供创新思路与实用工具

靶向蛋白降解（Target Protein Degradation，TPD）是针对“不可成药”蛋白治疗很有前景的策略，超 85%蛋白因缺乏明确配体结合口袋结构而“不可成药”。虽多种 TPD 策略涌现，但发现靶蛋白特异性配体仍是主要难题，现有策略在靶蛋白结合环节受阻。适配体可通过SELEX系统筛选结合靶点，寡核苷酸细胞内递送方法成熟，但此前在 TPD 研究中利用有限，且每个降解分子需在适配体与 E3 连接酶结合配体间单独偶联，开发简单稳健的降解分子衍生方法至关重要。

本文旨在设计一种由适配体和N-降解决定子 PNA 构成的组合系统，作为简单且稳健的靶向蛋白降解策略。借助互补序列杂交优势，将其应用于任何经 SELEX 筛选出适配体的目标蛋白。

AptaGron 系统由适配体与含N-degron肽的肽核酸（PNA）杂交组成。N-degron肽基于含精氨酸的N端肽设计，添加 RLAAAC 接头与适配体 5′端互补序列，还设计不同长度（9和18nt）及序列组成（AT丰富和GC丰富）的接头系列，利用细胞N端规则途径降解蛋白。

选tau、nucleolin和eIF4E三种缺乏选择性小分子配体且疾病关联明确的蛋白，且亚细胞定位不同，tau和eIF4E在细胞质中，nucleolin在核内。

2.AptaGron 系统稳定性、接头优化及降解效果研究

图 2.（a）AptaGron 系统示意图。（b）^wtaptamer^tau、^GC18ntaptamer^tau 和杂交的^GC18ntAptaGron^tau在磷酸盐缓冲盐水（PBS）缓冲液（pH 7.4）中的稳定性概况。（c）在长达 48 小时的细胞裂解液暴露下 AptaGron 的稳定性。

在 PBS 和细胞裂解液中检测AptaGron稳定性，发现48小时内无显著降解，细胞裂解液中半衰期24小时。用含不同接头的AptaGron降解tau蛋白，18nt长接头比9nt更有效，确定18nt接头系统用于后续研究。

3.tau 蛋白降解研究

图 2.(d)AptaGron对tau的TPD。(e)在连续孵育时间下施用^GC18ntAptaGron^tau后，表达Tau-GFP的HEK293T细胞的荧光活细胞图像。(f)经^GC18ntAptaGron^tau处理后，表达Tau-GFP的HEK293T细胞的活细胞图像的荧光信号定量值的柱状图。(g)用^GC18ntAptaGron^tau处理后Tau-GFP的荧光信号显示的降解情况。(h)使用ImageJ对PAGE图像的荧光信号进行定量。 

神经元内Tau纤维缠结沉积是众多神经退行性疾病关键标志，纤维状Tau积聚引发神经毒性，促使开发消除Tau纤维缠结疗法。在AptaGron系统中，经连接子优化，以TauP301L转基因小鼠脑蛋白组验证，AptaGron可降解动物样本中外源过表达及内源性Tau，且对致聚集突变体TauP301L有效。于活细胞中，因适配体负电致细胞通透性差，经脂质体转染递送AptaGron，监测表达Tau-GFP的HEK293T细胞发现其降低 Tau 表达，活细胞荧光成像与PAGE分析确证降解，虽受递送试剂细胞毒性限制剂量范围，但数十微摩尔浓度仍有效。

4. nucleolin 和 eIF4E 降解研究

图 3. (a)给予浓度为 10 μM 的^AT18ntAptaGron^nuc 处理 40 小时后，对核仁素降解情况的WB分析。(b)用浓度为 10 μM 的^AT18ntAptaGron^nuc处理 MCF7 细胞后的免疫细胞化学图像。(c)从免疫细胞化学获得的荧光强度分布柱状图。(d)对 tau、核仁素和eIF4E的WB分析，以及有无蛋白酶体抑制剂MG132共同处理的情况。(e)用浓度为10 μM的^GC18ntAptaGron^eIF4E处理 MCF7 细胞后的免疫细胞化学图像。(f)免疫细胞化学图像的荧光强度柱状图。

将先前报道的nucleolin及eIF4E的适配体添加18 nt 连接子构建AptaGron。鉴于nucleolin适配体含重复GGT序列，选富含AT的连接子构建^AT18ntAptaGron^nucleolin，经热退火制得复合物后用于 MCF7乳腺癌细胞裂解液，蛋白质印迹分析显示nucleolin降解条带强度随孵育时间降低。用转染试剂测试细胞递送，12小时后检测到其表达下调且呈剂量依赖性，免疫细胞化学图像表明核仁素定位细胞核，孵育中染色信号强度与绿色斑点数量减少。

用富含GC 的18 nt连接子制得^GC18ntAptaGron^eIF4E，体外可降解eIF4E，加蛋白酶体抑制剂MG132可抑制降解，表明此过程依赖泛素-蛋白酶解。将其用转染试剂递送至活细胞，12小时和24小时出现类似下调模式及剂量依赖性反应，免疫细胞化学图像确证eIF4E位于细胞质，蛋白质印迹与免疫细胞化学法均持续检测到降解。

5. AptaGron 系统特性及优势分析

图 S8. 用于三元复合物形成的免疫沉淀蛋白质印迹分析（IP-WB）

降解机制与复合物形成验证：确认通过“UBR1-AptaGron-靶蛋白”三元复合物实现降解，不改变靶蛋白 mRNA 转录水平，虽然PNA 接头序列可能有脱靶效应，但 AptaGron 的 PNA:DNA 杂交结合熔解温度高，生理条件下不易解离。

图 S10. AptaGron与免疫调节药物来那度胺（CRBN）配体偶联适配体之间靶蛋白降解情况对比。

与传统 PROTAC 对比优势：在CRBN E3连接酶低表达细胞中，AptaGron 比传统 CRBN-配体 PROTAC 具优势，为E3连接酶低表达、无合适的配体或靶蛋白配体未确定情况提供替代方案。

AptaGron 方法具有作为一个可靠的靶向蛋白降解平台的潜力，后续可以从提升靶选择性和降解效率需开发高亲和力适配体，优化 N-degron PNA结合亲和力，精心设计PNA接头减少脱靶效应，改进细胞摄取方式等方面进行优化。同时探索细胞穿透肽等技术改进细胞摄取，推动 AptaGron 技术升级，拓展其在疾病治疗中靶向蛋白降解的应用前景。 

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