#文献分享# 超高亲和力（低至 150 pM）的适配体筛选方案

今天介绍一篇最新发表在small methods上的文章Dimeric DNA Aptamers for the Spike Protein of SARS-CoV-2Derived from a Structured Library with Dual RandomDomains。文章主要介绍了一种用于筛选针对 SARS-CoV-2 刺突蛋白（S 蛋白）的二价 DNA 适配体的新策略，通过独特的双随机结构域（DRD）文库设计，直接筛选出具有高亲和力的适配体，为应对新冠疫情及未来可能的大流行提供了有潜力的分子识别工具。

核酸适配体是能折叠成 3D 结构与靶标结合的单链寡核苷酸，通过 SELEX 技术筛选，可用于诊断和治疗，但提高其结合亲和力面临挑战。

多价适配体策略可增强结合亲和力，直接筛选多价适配体的策略更具优势，本文采用含柔性多聚胸腺嘧啶（poly-T）连接体的双随机结构域文库筛选二价适配体。

开发一种能够直接筛选出针对 SARS-CoV-2 刺突蛋白（S 蛋白）的高亲和力二价 DNA 适体的策略，以解决传统构建多价适配体过程繁琐且耗时的问题，为新冠疫情及未来可能的大流行提供更有效的分子识别工具。

图 1. 从双随机结构域（DRD）文库中筛选二聚体适配体。

文库设计：DRD 文库含两个 25 核苷酸随机区域（LRD 和 RRD），由 20 核苷酸 poly-T 连接体（T20）连接，两端引物设计成稳定发夹茎结构，随机区域核苷酸长度选择基于前期研究，旨在保留形成复杂二级结构的能力并避免文库过长带来的问题。

筛选过程：以 SARS-CoV-2 奥密克戎 BA.5 亚变体的组氨酸标签三聚体 S 蛋白为靶标，通过磁珠筛选法进行 16 轮筛选，每轮包括结合、洗涤、洗脱和扩增步骤，筛选压力逐渐增加，同时利用 EMSA（Electrophoretic Mobility Shift Assay，即电泳迁移率变动分析） 评估各轮文库池结合亲和力，发现第 6 轮至第 8 轮结合亲和力显著提升，后续虽有增加但趋于平稳。

高通量测序与分析：对 16 轮筛选后的文库进行高通量测序，前 50 个独特序列占第 16 轮文库的 30.143%，可分为 14 个不同类别，部分类别共享相同 LRD 或 RRD，表明该文库能发现针对多亚基蛋白靶标的多样化适配体。

2.筛选前5 类适配体（DRDA1、3、5、8、10）

评估前 5 类适配体结合亲和力：选取每类中丰度最高的序列（DRDA1、3、5、8、10）代表 5 个主要类别进行结合亲和力测试，采用标准斑点印迹法，结果显示这 5 种适配体对 S 蛋白的结合亲和力均低于 1 nM，优于单体和二价对照适配体，其中 DRDA8 亲和力最高。

图2.DRDA1、DRDA3、DRDA5、DRDA8 和 DRDA10 五种代表 DRD 适配体不同类别的二级结构相关信息，以及对其特定序列的核苷酸保守性分析。

预测前 5 类适配体二级结构：DRDA1、3、5、8、10 的二级结构预测显示，它们采用三向连接结构，多数适配体的 P2 - L2 左臂相同，DRDA8 的 L2 和 L3 序列高度相似，且 DRDA8 和 DRDA10 右臂序列相似，基于这些发现选择 DRDA8 和 DRDA10 进行进一步表征。

图 3. 评估 DRDA8 和 DRDA10 与工程化表达 SARS-CoV-2 奥密克戎 BA.5 S 蛋白的假型慢病毒（PV）的结合亲和力。

DRDA8 和 DRDA10 与假型病毒结合能力：测试 DRDA8 和 DRDA10 与表达奥密克戎 BA.5 S 蛋白的假型慢病毒（PV）结合能力，二者均能结合 PV，值分别为 2.8 fM 和 4.3 fM，高于之前的二价适配体，对缺乏 S 蛋白的对照病毒（CV）无结合能力。

3.DRDA8 和 DRDA10 的二价特性表征

截断突变体分析：通过截断 DRDA8 和 DRDA10 的结合臂（P2 和 L2 或 P3 和 L3）及发夹引物（P1），发现结合臂对结合活性至关重要，二者协同作用增强亲和力，发夹引物对结合活性影响不大，且截断后的适配体可能具有实际应用优势。

图 5. DRDA8T1 和 DRDA8T2 与 S 蛋白结合的竞争实验。

竞争实验：用非放射性 DRDA8T2 与放射性 DRDA8T1 竞争结合 S 蛋白，结果表明 DRDA8 的两个结合臂作为同型二聚体，识别三聚体 S 蛋白不同亚基上的相同表位，对 DRDA10 的类似实验也得到相同趋势。

图 6. DRD 适配体多聚胸腺嘧啶（poly - T）连接体分析。

4.T - 连接体缩短分析

发现筛选过程中 poly - T 连接体长度从 20 核苷酸逐渐减至 10 核苷酸，推测可能是 PCR 偏差或进化驱动，通过测试连接体长度改变的 DRDA8 突变体结合亲和力，发现连接体长度变化对亲和力影响不大，表明该趋势可能是 PCR 偏差。

5.DRDA8 和 DRDA10 选择性评估

DRDA8 和 DRDA10 对与 SARS - CoV - 2 无关的蛋白（牛血清白蛋白、人- 凝血酶、人免疫球蛋白 G）无结合，对与 SARS - CoV - 2 S 蛋白有一定相似性的蛋白（如 SARS - CoV - 1 和 MERS 的 S 蛋白、部分冠状病毒的 RBD、流感病毒的 H 蛋白）结合极少，证明 DRD 文库策略产生的适配体具有高特异性。

DRD 文库策略能在单次筛选中获得对 S 蛋白具有 “二聚体样” 亲和力的适配体，DRDA8 和 DRDA10 的结合亲和力优于之前的单体和二聚体适配体，是目前针对 S 蛋白亲和力最高的适配体之一。

实验表明 DRDA8 和 DRDA10 的结合臂对高亲和力靶标识别至关重要，可能协同作用提供高结合亲和力，且 DRDA8 表现出同型二聚体特性，未来可研究开发异型二聚体配置以增强结合能力。

DRD文库策略为未来适配体筛选提供了一种高效方法，可快速生成高亲和力二聚体适配体，在应对未来大流行时，对快速获取诊断和治疗的分子识别元件具有潜在应用价值。